Quelle est la différence entre CRISPR et les enzymes de restriction?

Une enzyme de restriction reconnaît une séquence spécifique (propre à chaque enzyme) et effectue une coupe. Par exemple, EcoRI reconnaît la séquence nucléotidique GAATTC et la coupe pour qu’elle devienne deux fragments avec des surplombs comme le montre l’image suivante


Notez qu’aucun nucléotide n’est supprimé / ajouté. Si la séquence est religatée, c’est encore la même séquence.
Pour la digestion de restriction, tout ce dont vous avez besoin est un ADN, une enzyme et des conditions de tampon spécifiques.

Cependant, les choses sont un peu compliquées dans CRISPR / Cas9. Ici, vous pouvez choisir n’importe quel site dans l’ADN à condition que certains critères soient satisfaits comme une séquence PAM (requise pour la reconnaissance de Cas9, nGG, n = n’importe quel nucléotide).


Voici comment ça se passe
1) choisir un site cible
2) concevoir un ARN guide polynucléotidique contenant les bases complémentaires de votre site cible (la partie de l’ARN guide se liant à l’ADN cible) et le reste de la séquence est nécessaire pour un repliement conformationnel correct pour la reconnaissance par l’enzyme Cas9 (bulle bleue).
3) Injecter les embryons / traiter les cellules (je travaille avec des embryons de grenouille) avec un. ARN guide, b. Enzyme Cas9 (ARNm ou protéine).

Une fois que l’ARN guide se lie à la séquence cible, l’enzyme cas9 reconnaît le site et effectue une cassure double brin dans la séquence d’ADN juste avant la séquence PAM. Cela résulte en INDELS (insertions / suppressions). SO la séquence n’est pas la même après la rupture qui entraîne une perte complète de la fonction du gène (knockout).

Cela se produit par une recombinaison homologue ou une jonction de terminaison non homologue pendant le cycle cellulaire pour réparer le dommage.

Une administration plus simple

S’amuser.

Les deux enzymes de restriction et Cas9 (partie du système CRISPR) sont des endonucléases, ce qui signifie qu’elles coupent l’ADN quelque part au milieu d’un brin, plutôt que de prendre des bases de la fin. La différence fonctionnelle principale réside dans le mécanisme par lequel ils reconnaissent la séquence qu’ils sont censés couper.

La différence la plus importante est que, pour les enzymes de restriction, le site de coupe est “câblé” dans la structure de la protéine. Une enzyme de restriction donnée ne peut couper que sur un site particulier. Afin de faire une enzyme de restriction qui reconnaît un nouveau site, il faudrait concevoir une protéine complètement nouvelle. Malheureusement, nous n’en savons pas assez sur la manière dont les protéines se replient pour concevoir efficacement de nouvelles enzymes.

Cas9 d’autre part est guidé vers son site de coupe par un seul ARN guide (sgRNA) qui cible uniquement la séquence d’ADN à laquelle il est complémentaire. Cela signifie qu’au lieu d’élaborer une protéine entièrement nouvelle, si nous voulons cibler un site spécifique, nous pouvons simplement changer la séquence d’ARNsg, dont les techniques sont courantes depuis plusieurs décennies.

Il y a d’autres particularités à propos de chaque système, mais c’est la différence fondamentale entre les deux, et pourquoi CRISPR a fait un tel splash énorme. Auparavant, il était extrêmement difficile de couper l’ADN à une séquence ciblée. Les enzymes de restriction n’étaient jamais vraiment une option réalisable pour cela, mais des techniques ont été développées pour concevoir des endonucléases spécifiques (TALEN et ZFN). Cependant, ils ont demandé beaucoup de temps et d’argent. Avec CRISPR, cela prend quelques jours.

EDIT: J’ai oublié de mentionner que les ZFN et les TALEN (mentionnés ci-dessus) utilisent souvent le domaine de coupe non spécifique de FokI, qui est une enzyme de restriction. Cependant, le domaine de reconnaissance d’ADN n’est pas basé sur des enzymes de restriction.

Ajoutant à la réponse de Sudhakar, Cas9 peut également être utilisé pour les raisons suivantes:

1. Le remplacement du gène, car les cassures double brin qu’il produit peuvent induire une recombinaison avec un fragment d’ADN homologue (mais pas nécessairement identique) introduit par l’expérimentateur.

2. Activation ou inhibition de la transcription de tout gène – spécifié par leur liaison à l’ARN guide – si une version catalytiquement inactive est fusionnée avec un activateur ou un répresseur.

Bonne question mais assez simple à répondre. Les enzymes de restriction ont une fonction globale sur un morceau d’ADN, ils vont couper ce brin à des sites spécifiques, où et souvent ils le trouvent. Donc, bien que les sites auxquels il va se produire peuvent être définis, le processus de coupe est incontrôlable.

D’autre part, CRISPR est extrêmement contrôlable car il est guidé par un morceau unique d’ARN, donc il ne coupe que lorsqu’il trouve cette séquence. Il a été possible d’utiliser ce système non seulement pour découper une seule paire de base, mais aussi pour la remplacer par une autre!